眼睑松弛症脱垂泪腺的组织病理学研究
本文原载于中华眼科杂志,,56(03):-.DOI:10./cma.j.issn.-..03.
眼睑松弛症以反复发作的无痛性、无红斑形成的眼睑皮肤水肿为特征，多见于青少年发病，可累及局部眼睑或全眶周组织[1]。这种水肿通常对于抗组胺和糖皮质激素类药物治疗无明显效果，目前最有效的治疗方法仍是在稳定期后进行手术治疗[2]。反复水肿以及长期的炎性反应刺激损伤了眼睑的组织结构导致眼睑皮肤变薄萎缩、弹性消失、皱褶增加以及眼睑皮肤毛细血管迂曲扩张等症状，进一步导致上睑下垂、眶脂肪脱垂、泪腺脱垂、内外眦畸形、角膜溃疡等并发症。年Koursh等[1]总结发现眼睑松弛症并发眶组织脱垂占20%，女性多于男性，临床表现为泪腺窝饱满、眼睑水肿无压痛，可于外上眶缘下触及皮下活动肿物。虽然眼睑松弛症病因及发病机制尚不明确，但研究表明眶部脂肪或泪腺脱垂，可能与免疫机制导致的眶隔组织萎缩相关[3]。本研究通过分析眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者泪腺组织的病理学改变，探讨可能造成眼睑松弛症及并发畸形的原因。
对象与方法
一、对象
病例对照研究。收集年1月至年12月就诊于首都医科医院眼整形科手术治疗的眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者23例（30只眼）的30伤泪腺组织标本（患者及其家属签署知情同意书，允许将手术中所截取组织应用于研究，研究符合《赫尔辛基宣言》中的伦理学标准，伦理批号TRECKY-）。所有患者均行眼科专科检查排除单纯性泪腺脱垂、单纯性眶脂肪脱垂、单纯性上睑下垂等其他眼部疾病，行内分泌及血液系统检查排除全身免疫或内分泌系统疾病；行眼眶CT检查，排除眶部肿瘤等疾病。所有患者均在病程进入稳定期后行手术治疗，根据泪腺脱垂程度，行泪腺组织固定复位术[4,5]。将手术中截取的不需要的泪腺腺体组织或筋膜组织（约3mm×3mm×5mm）行组织病理学检查。对照标本取自首都医科医院眼库8份正常的单侧新鲜眶部泪腺组织。
二、方法
1．泪腺组织病理学检查：
泪腺组织均在手术获取后固定保存，对标本进行HE染色、Verhoeff-Van-Gieson染色，染色步骤严格按照制造厂家说明书进行[6]。
2．免疫组织化学染色：
检查泪腺组织中IgA、IgG、IgM、白细胞分化抗原CD3、CD20、基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）-3、MMP-9、补体C1抑制物的表达。均选用已知该成分的组织作为阳性对照，阴性对照为未加一抗染色。每张切片于倍光学显微镜下对全视野泪腺组织进行观察，以细胞质或细胞膜中出现黄色或棕黄色颗粒为其阳性判定标准，并根据半定量分析方法，将阳性着色程度分为4级：不着色=0分，着色淡者为弱阳性=1分，着色适中者为中等阳性=2分，着色深者为强阳性=3分；同时按照着色细胞所占百分比记为：0~5%=0分，6%~25%=1分，26%~50%=2分，51%~%=3分。二者乘积为最终抗体表达程度：0~1分为阴性（-），2~3分为阳性（+），4~6分为中强阳性（++），6分为强阳性（+++）[7]。
3．免疫电镜检查：
取眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者4份泪腺组织和1份对照泪腺组织切割成体积约2mm×2mm×2mm的组织块置于体积分数4%多聚甲醛和0.25%戊二醛配制的溶液中固定保存。采用包埋前标记方法，先后加入Ⅰ抗（鼠抗人MMP-3单克隆抗体1∶、兔抗人MMP-9多克隆抗体1∶50）、Ⅱ抗（直径10nm羊抗小鼠IgG-胶体金、羊抗兔IgG-胶体金，1∶50），超薄切片机切片80μm，透射电子显微镜（JEOLJEM-PLUS）下观察并照相[8]。
三、统计学分析方法
采用SPSS19.0统计学软件，患者标本与对照标本各检测指标的比较采用非参数Wilcoxon符号秩检验。P0.05为差异有统计学意义。
结果
一、一般情况
23例眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者中男性3例，女性20例；平均发病年龄11岁（7~16岁）；单眼发病4例，双眼发病19例。对照泪腺组织来自3例男性，5例女性；年龄10~20岁，平均年龄15岁。
二、组织学观察
对照正常泪腺标本HE染色示泪腺腺泡大小均匀，排列紧密，薄层结缔组织将腺组织分成大小不等的小叶，可见少量散在分布的淋巴细胞和浆细胞（图1中A）；Verhoeff-Van-Gieson染色示腺周结缔组织胶原纤维颜色均匀，排列规则紧密（图1中B）。眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者30份泪腺组织标本中，仅有2份标本表现为明显的腺腔增大，导管扩张，胞核、胞质固缩，胞质红染，间质中脂肪细胞浸润及淋巴细胞、嗜酸细胞增多（图1中C），其余样本与对照正常泪腺无明显差别或仅伴有慢性炎性反应改变；但观察泪腺周围筋膜组织，均发现胶原纤维断裂、排列紊乱，Verhoeff-Van-Gieson染色加深、不均匀（图1中D）。
图1
光镜下观察泪腺组织标本病理学染色结果 × A示对照者（男性，20岁）右眼正常泪腺组织标本HE染色可见泪腺腺泡大小均匀，排列紧密，薄层结缔组织将腺组织分成大小不等的小叶，可见少量散在分布的淋巴细胞和浆细胞；B示图A对照者标本Verhoeff-Van-Gieson染色可见泪腺周围筋膜组织胶原纤维颜色均匀，排列规则紧密；C示双眼眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者（男性，15岁）右眼泪腺组织HE染色可见泪腺腺腔增大，导管扩张，胞核、胞质固缩，胞质红染，间质中脂肪细胞浸润及淋巴细胞、嗜酸细胞增多；D示图C患者泪腺组织Verhoeff-Van-Gieson染色可见泪腺周围筋膜组织胶原纤维断裂、排列紊乱，着色加深、不均匀
三、免疫组织化学染色结果
眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者泪腺组织中IgA、CD3、MMP-3和MMP-9的表达高于对照泪腺组织，差异有统计学意义（均P0.05）（图2，表1），而IgG、IgM、CD20、补体C1抑制物的表达与对照泪腺比较，差异均无统计学意义（均P0.05）（表1）。
表1
眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者泪腺组织与对照者正常泪腺组织的免疫组织化学染色表达强度分布的比较（标本份数）
图2
光镜下观察泪腺组织免疫组织化学染色结果 二氨基联苯胺染色× A示对照者（女性，22岁）左眼正常泪腺标本IgA表达阴性；B示双眼眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者（女性，15岁）左眼泪腺组织IgA表达阳性；C示图A对照者标本白细胞分化抗原CD3表达阴性；D示左眼眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者（男性，13岁）左眼泪腺组织CD3表达阳性，箭头为CD3表达阳性的T淋巴细胞；E示图A对照者标本基质金属蛋白酶（MMP）-3表达阴性；F示图B眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者泪腺组织MMP-3表达阳性；G示图A对照者标本MMP-9表达阴性；H示双眼眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者（女性，13岁）右眼泪腺组织MMP-9表达阳性
四、胶体金标记的免疫电镜观察结果
对照正常泪腺组织中可见功能正常、结构完整的腺体组织，胞质中丰富的酶原颗粒分布均匀、形态规则，均无标记MMP-3和MMP-9的胶体金颗粒沉积；眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者泪腺腺泡细胞内的酶原颗粒形状失去规则的圆形或椭圆形，酶原颗粒表面可见标记MMP-3、MMP-9的胶体金颗粒沉积，腺泡细胞膜上可见标记MMP-3的胶体金颗粒沉积（图3）。
图3
采用免疫电镜技术观察泪腺组织胶体金颗粒标记结果 ×00 A示对照者（男性，15岁）右眼正常泪腺标本基质金属蛋白酶（MMP）-3表达阴性；B示双眼眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者（男性，15岁）右眼泪腺组织MMP-3表达阳性，可见标记MMP-3的胶体金颗粒（箭头）分布于酶原颗粒表面以及腺泡细胞膜上；C示对照者（女性，22岁）左眼正常泪腺标本MMP-9表达阴性；D示双眼眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者（女性，15岁）左眼泪腺组织MMP-9表达阳性，可见泪腺组织酶原颗粒失去正常形状，边界不清，密集分布，酶原颗粒表面可见标记MMP-9的胶体金颗粒（箭头）分布
讨论
泪腺位于眼眶上额骨外侧的泪腺窝内，其位置在眶缘的里面，眶隔的后方，被提上睑肌腱膜外角分隔成上、下两部，上方为眶部泪腺，下方为睑部泪腺。泪腺脱垂可作为一种并发的临床症状或者单一的临床诊断，多种眼睑疾病均可导致泪腺区的隆起，除眼睑松弛症外还可见于单纯泪腺脱垂、急性泪腺炎、甲状腺相关眼病、IgG4相关疾病以及泪腺肿瘤等疾病[9,10,11]，因此对于该病的鉴别诊断非常重要。
眼睑松弛症并发泪腺脱垂与单纯泪腺脱垂相鉴别，需注意前者泪腺脱垂出现在眼睑皮肤松弛症状之后，主要表现为双上睑颞上区隆起，翻转眼睑可于上穹窿结膜下见到脱垂的粉红色泪腺团块，通常不伴有提上睑肌功能及泪液分泌工能异常。组织病理学主要表现为泪腺慢性炎性反应[12]。本研究组织病理学结果显示，眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者的泪腺组织仅有2份标本表现为腺腔扩张，间质组织脂肪浸润及淋巴细胞、嗜酸细胞增多。进一步免疫组织化学染色分析，发现IgA、CD3、MMP-3和MMP-9与对照比较差异有统计学意义；IgG抗体与对照比较差异无统计学意义。在IgG4相关性疾病中，患者血清中IgG、IgG4升高，免疫组织化学染色显示IgG4+浆细胞30个/高倍视野，眼部可表现为无痛性泪腺肿胀[13]，可见眼睑松弛症引发的泪腺脱垂与该病及IgG4抗体无明显相关性。Custer等[2]认为眼睑松弛症并发泪腺脱垂主要是由于眶隔薄弱，炎性反应刺激进一步加重眶隔及泪腺支持韧带松弛，眼睑皮肤血液循环障碍，日久出现退行性改变，可同时产生脂肪疝出和泪腺脱垂。本研究结果显示泪腺脱垂的真正原因不在泪腺本身，推测为炎性反应侵袭了包被泪腺的筋膜组织，导致筋膜松解，固定作用减弱，从而导致泪腺脱垂，但何种物质激发了此种炎性反应还有待进一步研究。
既往有学者使用免疫荧光标记技术对眼睑松弛症患者眼睑皮肤组织进行抗体检测，发现真皮乳头层内断裂的弹性纤维及血管周围均有IgA沉积[14,15]。本研究免疫组织化学染色结果显示IgA在眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者泪腺组织中的表达与对照比较差异有统计学意义。说明IgA主要参与的免疫机制有引发眼睑松弛症炎性反应的可能，但何种物质诱导IgA在眼睑松弛症炎性反应区增多聚集有待进一步研究确定。此外，本结果显示眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者泪腺组织中CD3表达与对照比较差异有统计学意义，而CD20与对照比较差异无统计学意义。CD3为T淋巴细胞的特异性标志物，CD20为B淋巴细胞特异性标志物，由此可以推测，在眼睑松弛症免疫应答中，多为T细胞参与的细胞免疫为主，当然这种推测不能排除与该疾病的病程分期有关，本研究取材均为稳定期标本，相当于病程较晚期，分析可能此时期体液免疫已经处于消退状态，主要是细胞免疫起作用。
本研究中免疫组化染色结果显示眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者泪腺组织中MMP-3和MMP-9的表达高于对照，差异有统计学意义。MMP是一个大家族，其家族成员包括至少25种以上的蛋白水解酶，可以降解多种细胞外基质，同时还参与细胞内信号传导和基因调控程序[16]。这进一步验证了免疫机制引发的炎性反应促使弹性蛋白酶活性亢进，弹性蛋白酶抑制功能障碍，从而导致弹性纤维不断降解的假说[17,18]。文献报道MMP-3可以激活MMP其他成员[19]，由此分析，在眼睑松弛症免疫反应中MMP-3可以作为MMP-9的有效激活剂。MMP-3的激活物可以是生长因子、白细胞介素1、促癌因子或癌基因产物、淋巴细胞或巨噬细胞在组织中破坏的胶原纤维或者其他上游激活物，这些物质激发了免疫应答，从而活化MMP-3的蛋白水解作用，而与此同时，MMP-3也作为MMP-9的有效激活剂，促使包括胶原纤维在内的细胞外基质的进一步降解。由此推测MMP-3与MMP-9在眼睑松弛症并发泪腺脱垂的发病过程中可能存在某种级联反应关系，并参与胶原纤维的损伤修复过程。
胶体金标记的免疫电镜结果揭示了MMP-3和MMP-9的附着位点，免疫电镜下还观察到眼睑松弛症并发泪腺脱垂患者泪腺腺泡细胞内的酶原颗粒形状失去规则的圆形或椭圆形，而且泪腺腺泡及酶原颗粒表面也有胶体金颗粒沉积。这些结果都表明眼睑松弛症是一种炎性反应过程，所以通过抑制弹性纤维蛋白酶功能或修复弹性纤维蛋白酶抑制物的功能，可能对阻止胶原纤维分解起到一定作用[20,21]。
综上所述，眼睑松驰症并发泪腺脱垂的真正原因不在泪腺本身，推测为细胞介导的免疫应答机制，即炎性反应侵袭泪腺周围结缔组织，导致胶原纤维变性、筋膜组织松解断裂，固定作用减弱，致使泪腺脱垂。免疫组织化学染色结果显示在脱垂泪腺组织中IgA、CD3+T淋巴细胞、MMP-3和MMP-9阳性表达增加，这对该病的药物治疗和发病机制研究有一定意义。然而何种物质刺激引发这种特殊的免疫应答以及免疫反应的级联过程，探究参与的免疫因子或相关物质，需要进一步研究证明。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献
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