结膜松弛症手术切除组织中细胞增生及凋亡蛋
▲ 病例的临床诊断与分级参照Zhang等[2]提出的结膜松弛症诊断与分级标准。对确诊为结膜松弛症的患者进行详细的检查及手术评估，排除存在睑内翻、睑外翻、角膜疾病、泪点异常和泪道冲洗不通畅的患者。所有患者3个月内未发生影响眼表的眼病及全身性疾病，3个月内未眼局部用药。手术评估标准包括：(l)松弛结膜堵塞泪点导致明显溢泪者。(2)松弛结膜严重堆积导致结膜充血、眼睑闭合不全者。(3)各种眼表不适症状明显，经保守药物治疗3个月无改善，且自愿要求手术治疗者。根据上述标准，共收集年8月至年6月结膜松弛症手术30例，其中男14例，女16例，年龄68-82岁，平均(74.1±8.2)岁。同时选取正常组病例15例（15只眼），其中男7例，女8例，年龄65-80岁，平均(73.5±7.6)岁。
1.2手术标本的收集与制备
手术前所有患者均签署知情同意书。结膜松弛症患者的手术方式均采用结膜新月形切除术[3]。正常组标本来自自愿参加本研究、年龄与结膜松弛症组相匹配，在我院行单纯晶状体超声乳化吸出术的白内障患者[4]。术中均选取下方的结膜标本，大小约2mmx1mm。将取下的标本放入40g/L多聚甲醛液中固定48h。流水冲洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，转轮式切片机切成5μm2厚度切片备用。
1.3组织免疫荧光法
主要试剂与仪器为：B细胞淋巴瘤/白血病一2基因（B-cellymphma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白基因（Bcl-2associatedXprotein，Bax）、增生细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-containingaspartate-spe-cificproteases，caspase-3)单克隆抗体均来自美国Sigma公司。正置显微镜（型号CX41）和荧光显微镜来白OLYMPUS公司。具体方法为：(l)石蜡切片脱蜡脱蜡：60℃、30min；二甲苯I10min、二甲苯I10min。(2)水化：将脱蜡后的切片经%酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精、双蒸水各3min。(3)抗原修复：置0.OIM柠檬酸钠缓冲溶液中高压修复20-30min。微波过程中避免溶液沸腾，自然冷却。0.02MPBS洗5minx3次。(4)根据要求滴加合适比例稀释的Bcl-2、Bax、PCNA及caspase-3-抗，4℃孵育2h。(5)PBS漂洗5minx3次，不时震荡（洗去多余游离的抗体）。(6)滴加合适比例稀释的荧光二抗，4℃孵育1h。(7)防淬灭封片剂封片。(8)荧光显微镜拍片，拍照倍数为倍。计算阳性细胞面积代表每组结膜标本中荧光染色强度的相对值。
1.4统计学分析
使用SPSS21.0统计学软件进行统计处理，对各组的实验数据求均数及标准差，采用t检验对两组间的计量资料进行统计学处理，检验标准为P0.05。
2结果2.1手术切除的结膜标本中Bcl-2、Bax、PCNA及caspase-3的表达
结膜松弛症手术切除的结膜组织中Bcl-2阳性表达面积为(.30+63.24)μm2，正常结膜中为(.70+71.66)μm2，两组间Bcl-2表达的荧光强度差异无明显统计学意义(P=0.)。结膜松弛症结膜组织中Bax阳性表达面积为(.20±81.16)μm2，正常结膜中为(.60+70.51)μm2，Bax在结膜松弛症结膜组织中表达的荧光强度明显强于正常结膜组织(P=0.)。结膜松弛症结膜组织中PCNA阳性表达面积为(.60±94.64)μm2，正常结膜中为(.20±81.25)μm2，两组间PCNA表达的荧光强度差异无明显统计学意义(P=0.)。结膜松弛症结膜组织中caspase-3阳性表达面积为(.70±41.38)μm2，正常结膜中为(.90±56.66)μm2，caspase-3在结膜松弛症结膜组织中表达的荧光强度明显强于正常结膜组织(P=0.)，详见表1。两组结膜组织的免疫荧光染色见图1-4。
3讨论结膜松弛症是老年人的常见眼病，其患病率随着年龄的上升而增高。李青松等[5]研究表明上海市曹杨新村街道60岁以上人群中结膜松弛症的患病率为44.08%。结膜松弛症不仅会引起眼干涩、异物感及溢泪等诸多不适，还会影响美观，严重者甚至影响日常生活与T作。目前该病的发病机制并不明确，有学者人认为结膜松弛症成纤维细胞中基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMps)过度表达，致使胶原纤维溶解、弹力纤维明显减少可能导致结膜松弛症发生[6-7]。另外张兴儒等[8]收集结膜松弛症组和正常对照组泪液，发现结膜松弛症组中出现的部分调节凋亡相关蛋白质及炎症反应相关蛋白质在正常对照组中缺失。通过蛋白组学研究发现结膜松弛症泪液中炎症因子增加。这些都提示结膜松弛症可能与细胞凋亡和炎症有关，并且细胞凋亡可能是结膜发生松弛的重要推进因素。
细胞凋亡的相关基因中既有促进凋亡的基因，同时还存在抑制凋亡的基因，抑制凋亡的基因包括Bcl-2和Bcl-xl，促进凋亡的基因包括如Bax、Bcl-2相关凋亡促进因子(Bcl-2associateddeathpromoter，Bad)和B细胞淋巴瘤/白血病-XS基因(B-cellym-phoma-XS，Bcl-XS)。目前认为Bcl-2和Bax的比率决定了细胞凋亡。Bcl-2通常定位于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上。而大多数Bax蛋白则是以单体的形式定位于细胞浆中，少部分定位于内质网等细胞器[9]。在凋亡信号作用下，促凋亡成员发生构型改变，易位并插入线粒体外膜发挥促凋亡活性[10-11]。有报道发现，Bcl-2家族蛋白能调控线粒体促凋亡蛋白(secondmitochondria-derivedactivatorofcaspass，SMAC)等促凋亡蛋白的释放，从而激活caspase-3前体，导致细胞凋亡［12］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-containingaspartate-specificproteases，CASPase)是一切凋亡信号传导的共同通路，各种CASPase层层激活，最终引发细胞凋亡。有研究表明，caspases-3是已知的该家族成员中执行细胞凋亡的核心蛋白酶之一，是关键的效应分子，许多凋亡信号使之激活，从而使细胞质、细胞核及细胞骨架的重要蛋白酶失活，引发细胞凋亡［13-15］。而PCNA则与细胞增生活动密切相关，是一种评价细胞增生状态的重要指标，它可以作为DNA聚合酶的辅助蛋白直接参与细胞的增生活性[16]。
本研究发现Bax和caspases-3在结膜松弛症组织中的表达明显高于对照组，而Bcl-2和PCNA的表达与对照组并无明显差异。说明细胞凋亡是结膜松弛过程中在细胞水平的重要表现形式，这与张兴儒等[17]研究一致。正常组织中，细胞凋亡与增生处于一种天然的动态平衡，一旦任何一方出现失衡，就必然导致组织形态学的改变，在结膜松弛症中细胞凋亡与细胞增生的平衡紊乱主要表现为细胞凋亡的效应增强，从而出现结膜发生松弛的变化。然而我们发现结膜松弛症组织中两种细胞增生蛋白的表达与同年龄正常组相比变化不大，这可能与本研究选取的病例均为老年患者有关，随着年龄增大，其细胞增生能力已趋向减弱，故两组间并无明显差异。针对结膜松弛症中细胞凋亡的研究的价值不仅仅在于发现这一现象，更重要的是基于此点，我们可以进一步探索细胞凋亡的发生原因，解释同年龄中仅部分患者的结膜发生松弛，针对其原因治疗，或许能够找到治疗结膜松弛症的新方法。结合前期的研究，我们考虑结膜松弛症中诱发细胞凋亡的原因可能有：(l)炎症因素：结膜松弛症多伴随有慢性炎症刺激。研究发现在结膜松弛症中炎症相关蛋白、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor，TNF-a)、白介素-6(in-terleukin-6，IL-6)和白介素-8（inteheukin-8，IL-8）等炎性细胞因子及TNF-a刺激基因6(tumornecrosisfactoralphastimulatedgene-6，TSG-6)、穿透素-3（pentraxin-3，PTX3）等表达都呈现上调的趋势[18］，说明结膜松弛症的发生过程中始终伴随着炎症刺激，这些炎症因子长期作用，可能诱发细胞凋亡。(2)某些细胞内信号通路的激活。王晗敏等［19］发现在结膜松弛症组织中细胞外调节蛋白激酶(extra-cellularregulatedproteinkinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-junN-terminalkinase，JNK)及P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activatedproteinkinase.P38MAPK)三条信号通路比正常组织明显增强，而这些信号通路与细胞凋亡关系密切，可能与结膜松弛症中发生细胞凋亡有关。(3)MMPs与细胞凋亡的关系。已发现结膜松弛症中MMPs的表达上调，从而引起引起胶原纤维溶解，弹力纤维的变性，导致结膜松弛堆积[4]。而在许多领域，已发现MMPs能够诱导细胞凋亡的发生[20-21］。在结膜松弛症发病过程中二者是否相互影响，值得我们进一步研究。
结膜松弛的发生是一个复杂的病理过程，我们的研究认为，其中伴随着细胞凋亡与增生的平衡紊乱。通过探讨其发病机制中的细胞增生与凋亡相关理论，努力使这种凋亡及增生进程趋向于一种动态平衡，寻找治疗和预防结膜松弛症的新方法。
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来源：选自医学空间战略合作伙伴《中华眼外伤职业眼病杂志》年第38卷第11期,转载请注明出处！
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